抗真菌薬の代替は耐久性には有益ですが、一般的な耐性を犠牲にします。

Jan 01, 2024

Communications Biology volume 6、記事番号: 180 (2023) この記事を引用

838 アクセス

11 オルトメトリック

メトリクスの詳細

農薬に対する耐性の進化は農業にとって大きな負担となっています。耐性管理には、特に有効成分と異なる作用機序を組み合わせることで、選択圧の不均一性を最大化することが含まれます。我々は、経済的に重要な作物病原体に対する実験的進化アプローチを適用することにより、交代が選択圧力を長期にわたって分散させるだけでなく、交代殺菌剤に対する耐性の進化速度を低下させることによっても耐性の蓄積を遅らせる可能性があるという仮説を検証した。ジモセプトリア・トリチシ。我々の結果は、継続的な殺菌剤の使用と比較して、交代は中立であるか、全体的な耐性進化速度を遅くするものの、進化した系統ではより高いレベルの一般性をもたらすことを示しています。我々は、殺菌剤の数や交代のリズムよりも、殺菌剤の性質、したがってそれらの相対的な固有の耐性リスクがこのトレードオフの根底にある可能性があることを実証する。このトレードオフは、耐性の進化の過程でも動的に変化します。これらの発見は、交互コンポーネント間の相互作用を最適化しながら抵抗管理を効果的に調整するための新たな可能性を切り開きます。

人類は、十分な飼料、食料、燃料、繊維の確保など、多くの重大な課題に直面しています。作物の保護は、依然として多様な害虫を防除するための殺虫剤の使用に大きく依存しています。しかし、これらの有効成分 (AI) の有効性は、その使用の一般化によって損なわれ、耐性の急速かつ広範な進化につながっています 1,2。耐性は、農薬によって課せられた選択に応じた表現型の最適化とみなすことができ、現代の適応進化の多くの例を提供してきました3。病原菌、節足動物、雑草の耐性の進化によって生じるコストは毎年数十億米ドルに達し4,5、さらに農薬使用量の増加6や生物多様性への影響7,8による隠れたコストも伴います。したがって、耐性の進化を予防し遅らせるための賢明な戦略の使用は、持続可能な農業にとって重要です。

害虫や病原体の防除には、さまざまな動作モードを備えた多様な AI が利用できることがよくあります。したがって、抵抗力の進化を制限するために、これらの AI を時空を超えて巧みに展開する戦略を開発することができます 9,10。より正確には、農薬の配列、混合物、交互、モザイク、または用量戦略の最適化には、病原体および害虫の集団にかかる選択圧の不均一性を最大化することが含まれます11、12、13、14、15。無関係な AI の交替（サイクリング、ローテーション、定期的適用とも呼ばれる）は、1951 年にコインによって初めて提案され 16、これは世代間殺戮の複数の手段を提供し、耐性個体の子孫を殺す確率を最大化します 10。昆虫、雑草、病原体の防除戦略については、モデル化データと経験的データの間のランキングの不一致が指摘されているため、耐性を防ぐための交替の有効性については依然として議論の余地がある10、17、18、19。関係する生物の生物学的形質（例えば、生殖様式、種の倍数性、耐性対立遺伝子の優位性、農薬曝露に関する世代の期間と重複など）が、この相違の一部を説明している可能性がある。数学モデルでは形質が体系的に明確にされておらず、2 つのアプローチでは異なる世代数が考慮されました。しかし、交替のパフォーマンスのばらつき、そして実際には他の戦略のパフォーマンスのばらつきにより、戦略のどの要素が耐性の進化を遅らせるのに最も関連しているのかという疑問が生じます。実際、交代戦略における選択の不均一性は、交代する AI の数、関係する AI の性質、および採用される交代パターンによって異なります。

もう1つの制限は、戦略はほとんどの場合、耐性の進化に対する定量的な影響（耐性の頻度、健康な作物の割合、一定量の耐性に達するまでの時間、農薬の有効寿命など）に基づいて評価され、評価されることは稀であることです。耐性を持つ個人の特徴の基礎（例えば、耐性の強さ、交差耐性のパターン、性質と多くの耐性メカニズム）。これは、耐性の遺伝的基盤が実証研究でほとんど知られていない、または明示されていないため、または数学モデルが耐性形質が専門家であると想定しているためである可能性があります 20,21。それにもかかわらず、微生物、動物、植物で観察される耐性メカニズムの多様性はかなりのものです。これらのメカニズムの進化的起源も異なる可能性があります22。標的部位耐性（TSR）は、そのコード配列および/またはプロモーターまたは調節遺伝子における1つまたは複数の変化により、農薬の標的遺伝子の構造および/または発現に影響を及ぼし、その結果、同じ作用機序を持つAIに対する交差耐性が生じます。 (MOA)。 TSR の交差耐性のレベルが突然変異と MoA の間で異なる場合でも、このタイプの耐性は専門的な適応であると考えられます。対照的に、非標的部位耐性 (NTSR) には、AI の輸送、バイパス、解毒、排出、または隔離に関与する 1 つまたは複数の遺伝子の発現制御が関与します。これは一般に、異なる MoA を持つ AI に対する交差耐性につながり、通常はジェネラリストの特性とみなされます 23,24,25,26。進化実験の裏付けを得た理論によれば、スペシャリストは均質な環境で進化するのに対し、ゼネラリストは異質な生息地で進化する可能性が高い27。したがって、農薬への適応という観点から見ると、単一の AI を継続的に使用するのとは対照的に、交互戦略、混合戦略、またはモザイク戦略など、選択圧の不均一性が高まるにつれて、ジェネラリスト耐性がより容易に選択されることが予想されます。この仮説は除草剤混合物について検証されており、英国の全国調査では、さまざまな MoA の使用量の増加が、経済的に重要な雑草ブラックグラスの TSR レベルの低下と NTSR レベルの上昇（つまり、解毒）に関連していることが判明しました 28。同様の結果が臨床環境でも見られ、抗生物質が交互に使用される状況ではジェネラリスト耐性がより頻繁に選択されることも示されています29。全体として、これらの研究は、病原体のライフサイクルと比較した治療頻度の重要性を強調しています 30,31。したがって、特に一部の病原体では、処理頻度によって処理間隔が害虫の発生時間よりもはるかに長くなる可能性があるため、農薬に関しては、代替戦略の有効性の問題は未解決のままです。

ここでは、ヨーロッパで最も深刻な小麦の葉面病であるセプトリア葉斑病（STB）の原因である子嚢菌 Zymoseptoria tritici を一般モデルとして使用し、殺菌剤の交替成分が定量的および定性的パフォーマンスをどのように推進するかを決定します。この戦略の。この適応性の高い病原体は、大規模かつ多様な個体群と二重生殖様式を持ち、西ヨーロッパでは 4 つの異なる単一部位作用様式に対する野外耐性を進化させており、その結果、AI とその組み合わせに応じて野外有効性が対照的に低下します 34,35,36。 37、38、39、40。フランスで定量的に実証されているように、抵抗力学も MoA によって異なります 41,42。 Z. tritici は、さまざまな特定の標的部位の変異によって決定される TSR を示し、これは標的の過剰発現 40、43、44、45 に関連する可能性がありますが、流出の亢進による NTSR にも関連する可能性があります。この後者の一般的なメカニズムは、TSR に関連していない場合に弱い多剤耐性 (MDR) を引き起こし、少なくとも 3 つの作用機序に影響を与えます 43,46。これらの生物学的特徴とフィールド背景により、Z. tritici は、対照的な選択圧力下での個体群の適応を分析し、一般原則について推論するための教科書モデルとなっています。我々は、交替を模倣した体制下での耐性の選択に基づく実験的進化アプローチ48において、液体培地中でこの病原体の半数体酵母様の容易に培養可能な形態（すなわち芽胞子）47を利用した。選択パターンは、交代の 3 つの要素、つまり AI に対する耐性の本質的リスク、交代する AI の数、交代リズムの 3 つの要素を解きほぐし、選択された抵抗力学および選択された抵抗メカニズムに対するそれぞれの影響を評価できるように設計されました。我々は、交代ドライバー間の組み合わせと相互作用が、交代の量的性能（すなわち、全体的および殺菌剤固有の耐性進化速度）と定性的性能（すなわち、進化した菌株の汎用性の程度）との間の進化的トレードオフを明確に導き、可能性を広げることを発見した。植物病原性真菌において初めて、現場で情報に基づいてこの戦略を調整するための新しい視点が得られました。

我々は、56 年の実験的進化の後、ベンゾビンジフルピル (B)、カルベンダジム (C)、およびプロチオコナゾールデスチオ (P) に対する Z. tritici 耐性の動態を観察しました。ここでは 3 つの作用機序 (それぞれ SDHI、ベンゾイミダゾール、DMI) を表しています。独立した系統は、EC95選択用量でのB、CまたはPを含む、連続または交互のB、C、およびPの14のレジメンに供されました（図1aおよびb）。平均正規化マルサス成長率 \({M}_{{it}}^{n}\) (以下、全体的な抵抗力進化率 ρ と呼ぶ) が、抵抗力増加の代用として使用されました。 ρが対照線の少なくとも90%に達したとき、耐性の確立が宣言されました。耐性は、B、C、または P に継続的に曝露されたすべての集団で進化し、それぞれ 3、6、および 6 サイクル後に確立されました。これら 3 種類の殺菌剤で交互に処理した系統では、交互リズム (つまり、同じ AI の使用を受ける連続サイクル数) や交互に使用した殺菌剤の数に関係なく、耐性も進化しましたが、12 サイクル後でも耐性は確立されませんでした。状況によっては、中リスクから低リスクの AI も含まれます (図 1c)。 (単一化合物による) 直接選択を受けた系統の場合、ρ は B よりも C の方が 1.1 倍高く、P よりも C の方が 1.4 倍高かった。これらの有意差は、ベンズイミダゾール（高; C）、SDHI（中; B）およびDMI（低; P）に関連する耐性の相対的な固有リスクの階層を反映しています（補足図S1）。系統の全体的な耐性進化速度は交替体制によって修正され、カルベンダジムを含む交替体制では、この高リスクの殺菌剤に継続的に曝露した場合よりも 1.1 ～ 1.3 倍と大幅に低くなりました。したがって、交互作用により、C に対する耐性のリスクは、継続的な曝露条件下で中リスクおよび低リスクの殺菌剤で観察されるリスクと同様のレベルまで減少しました。単一 AI の使用と比較した場合、交互の利点はさらに顕著であり、低リスクと中リスクの殺菌剤を交互に使用した場合、または AI の殺菌剤を使用した場合には耐性選択が 25 ～ 58% 減少しました (ρ で推定)。 3つのカテゴリが交互に表示されました。したがって、交互に使用した殺菌剤に応じて、連続使用では単一の殺菌剤と比較して、交互に使用すると中立的な効果が得られるか、全体的な耐性の進化速度が低下しました。

a Z. tritici の感受性株 IPO-323 を使用して 56 株を見つけ、各三角フラスコに 107 個の胞子を接種しました。 14 パターンの選択を模倣するために、処理した系統に殺菌剤を添加しました。 7日後、集団の2%を新しい培地に接種して次のサイクルを開始し、必要に応じて未処理の対照系統からの移入によって補充して合計107個の胞子を達成した。この手順を、殺菌剤処理ごとに 4 つの複製系統で 12 サイクル繰り返しました。 b 3 つの殺菌剤と、2 つおよび 3 つの殺菌剤の可能なすべての組み合わせ (矢印とその特定のラベルと色で示されている) が研究されました: カルベンダジム (C; 黄色; 高リスク)、ベンゾビンジフルピル (B; 青; 中リスク)、プロチオコナゾール-desthio (P; 赤; 低リスク)。殺菌剤の各ペアについて、3 つの交互リズム (同じ選択によるサイクル数に応じて 1、2、または 3) がテストされました。 c いくつかの殺菌剤の改変は、効果的に耐性動態を弱めた。各処理系統について、サイクルの終了時に推定される正規化されたマルサス増殖が時間の関数として示されます。色は処理されたラインを示し、記号 (三角形、丸、四角) は、所定のサイクル中に適用された殺菌剤 (それぞれ C、B、および P) を示します。各サイクルおよび選択レジームについて、これらの大きなシンボルは観測値の平均を表し、個々の観測値は明るい点で示されます。全体として、連続曝露を受けた系統では耐性が進化し、6サイクル以内に確立されましたが、交互曝露を受けた系統では確立が遅れたか、12サイクル（1BP、2BP）後でもまだ到達していませんでした。

交替は、特定の殺菌剤への総曝露時間を制限することによって、また潜在的に選択圧力の多様化を通じて全体の耐性進化速度ρを変更することによって、特定の殺菌剤に対する耐性の選択を減らす可能性があります。我々は、殺菌剤 f の曝露に対応する時間セグメントのみ ρ を比較することにより、交互の多方向選択の潜在的な影響を曝露時間の減少の影響から分離して調査した (ρf、以下、殺菌剤固有の耐性の進化と呼ぶ)速度）、および交番成分によって異なります（図2a）。 ρf に対する交替の影響は、交替パートナーに関連する抵抗の本質的なリスクに大きく依存していました。実際、高リスク殺菌剤に対する耐性の選択は、当該殺菌剤を低リスク殺菌剤と代替した場合にのみ減少した(9%)。低リスクの殺菌剤を使用した場合のみ、中リスクの殺菌剤の使用に伴う選択圧力を（22%）減少させることができました。中リスクおよび高リスクの交代パートナーは、低リスク殺菌剤に対する耐性の選択率に対して、それぞれ中立または有害 (+82%) の影響を及ぼしました。全体として、殺菌剤の選択能力は、リスクが十分に低い殺菌剤に変更することによってのみ減少しました。したがって、交替における選択圧力の低下は、常に抵抗性の本質的リスクが低いパートナーの選択能力を犠牲にして達成された。この結論は、3 種類の殺菌剤を交互に使用する戦略にも適用されました。同じ殺菌剤への連続曝露期間（サイクルにわたる交互リズム）の影響は小さく、最も長いシーケンス（3 サイクル）および 18 の可能な比較のうち 2 つだけで耐性進化率が増加しました。最後に、殺菌剤固有の耐性進化速度は、主として、その交代パートナー自身の耐性リスクに対するその交代パートナーの固有の耐性リスクによって決まり、次に、交代する殺菌剤の数や交代リズムなどの他の交代要素によって左右されました。

殺菌剤 f への曝露時間における耐性進化の平均速度である a ρf は、左側に交互 AI の関数として、右側に各交互ペアの交互リズムの関数として示されています。エラーバーは標準誤差を表します。ペアごとの比較の P 値は、線形モデル (Tukey の事後補正) を使用して計算されました。「ns」は有意ではありません (P > 0.05)、*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。交互に使用すると、低リスク殺菌剤 (P) と高リスク殺菌剤 (C) を交互に使用した場合を除き、連続曝露に比べて耐性の進化が減少しました。リズムオルタネーションの効果が弱いことが多い場合でも、速いオルタネーション (低いリズム) が推奨されます。 b マルサス的成長 \({M}_{{it}}^{n}\) に対する交互成分の影響は、いくつかのしきい値に到達するのに必要な曝露時間として示されます。これらの結果は Cox 分析によって推定され、f に連続的に曝露された系統と比較して、これらの臨界値に達するまでの殺菌剤 f 曝露のサイクルとして表されます。上から下へ: C、B、P。四角は、95% 間隔での推定効果とエラーバーを表します。黒と白の四角は、それぞれ有意な効果と非有意な効果に対応します。交替は、高系統の交替パートナーに関係なく、主に抵抗確立期（抵抗＞90%）に、マルサス的成長にプラスの効果をもたらしました（つまり、特定の閾値に達するまでにかかる時間は、交替体制にさらされた系統の方が長かった）。 -リスク殺菌剤C、ただしBとPは交代パートナーに依存する。低リスク殺菌剤Pの場合、マルサス増殖に対する交代の効果はマイナスであった（すなわち、より高い耐性リスクを持つパートナーとの交代により、閾値に達するまでにかかる時間が短縮された）交代の初期段階で。

集団における耐性の頻度の変化は、通常、低耐性の出現段階 (<15%; ここでは、実験条件で OD405 の変化を測定することで確実に検出できる最低頻度)、選択段階 (ここでは、抵抗率は 15% ～ 90%、慣例として選択されています) と抵抗確立段階 (ここでは 90% 以上)13。コックス生存分析を使用して、平均正規化マルサス増殖の所定の閾値に到達するのに必要な曝露時間（所定の殺菌剤によるサイクル数）に対する交替成分の影響を調査した。図2bは、交代成分に応じて、\({M}_{{it}}^{n}\)の臨界値に達するまでに増減した殺菌剤曝露のサイクル数を、同じ殺菌剤に継続的に曝露した系統と比較して示しています。。交代により、高リスク殺菌剤の耐性進化速度は、初期段階ではなく、主に選択段階の終わりに向かって、および耐性確立段階中に減少しました（2 つの交互の場合、耐性確立段階が 0.77 サイクルおよび 1.31 サイクル遅延しました）と 3 つの AI がそれぞれあります）。中リスクおよび低リスクの殺菌剤の場合、耐性確立段階のこの有益な遅延は、可能な限りリスクの低いパートナーとの交替の場合にのみ観察されました（それぞれ 1.70 および 1.01 曝露サイクル遅延）。リスクパートナーは、耐性確立段階に到達するまでに必要な時間を短縮します（それぞれ 1.22 および 2.42 曝露サイクル）。対照的に、より高い耐性リスクを持つパートナーと交替すると、一般に、特に出現期および初期選択段階（1.52～2.13 曝露サイクルまで）において、低リスク殺菌剤に対する耐性の選択率が増加した。

したがって、交代中に各殺菌剤によって及ぼされる相対的な選択圧力は、選択体制とその成分によってだけでなく、耐性動態の段階によっても変化した。時間の経過に伴うこの対照的な選択パターンは、耐性リスクに応じて多かれ少なかれ急速に耐性が広がるため、交替パートナーの有効性が低下することでまず説明できます。実際、低リスクの交替パートナーは、高リスクの交替パートナーよりも長く（つまり、おそらく抵抗力学の最新段階まで）個体群サイズを制御する可能性があり、これにより、我々のプロトコールによれば、対照系統からのより多くの移入が起こり、その後、より大きな希釈が起こる。今後の選択サイクルを開始する集団内で選択された耐性。対照的に、高リスクの交替パートナーは、より早く効力を失うものの、特に対照系統からの感受性細胞の移入が急速に不要となるため、選択の初期段階から耐性選択を増加させることが期待される。観察された選択進化のパターンは、この理論的根拠と世界的に一致しています。しかし、観察されたパターンと予想されたパターンの間の不一致は、適応ランドスケープの探索、つまり、全体的な選択圧力に適応するために、実験の過程で適応度を高めるさまざまな突然変異の連続的な選択から生じる可能性があります。したがって、我々は、概念実証を得るために、連続曝露下の体制（線0B、0C、および0P、図3）における人口構成の経時的変化を分析しました。予想通り、耐性プロファイルは一般に狭く、継続的な選択に使用される殺菌剤に対する耐性に主に焦点が当てられていました。ただし、表現型の抵抗プロファイルは、異なる抵抗力学段階間で大きく異なりました。 AMOVA 分析では、選択体制内の多様性は常に選択体制間の多様性よりも大きかったが、進化を通じて集中しており、その方法は選択圧力を及ぼす殺菌剤によって異なりました。高リスクの殺菌剤 (C) により、最終的に 4 つの高度に特殊化されたプロファイル (平均 1.25 AI に耐性) の選択が決定されました。対照的に、中リスクおよび低リスクの殺菌剤 (B および P) は、交差耐性と耐性強度の両方の点で異なる複数の耐性表現型を選択しました。中リスクの殺菌剤は、平均 2 つの AI に対する耐性のパターンを選択しました。低リスク殺菌剤によって選択されたパターンは最も一般的であり（平均 4 つの AI に対する耐性）、多くの場合、いくつかの病原体における多剤耐性の指標であるトルナフテートに対する耐性が含まれていました 43。交互の系統では、AI が世代を超えて互いに継承していくにつれて、単一の AI に対するこのような対照的な適応パターンが定期的に繰り返されるはずであり、その結果、さらに複雑な軌跡が得られます。

スコアリングスケールを使用して、識別用量の殺菌剤を補充した固体培地上での分離株の増殖を評価しました（液滴試験）。各分離株について、同じプレート上で 4 つの胞子濃度をテストしました。 0: 増殖なし (感受性分離株)。 1 ～ 4: 胞子濃度に応じて成長が変化します (耐性分離株)。試験された殺菌剤には、B、C、および P が選択用量、この用量の 2 倍、および混合物で含まれ、さらに実験では使用されなかった殺菌剤 (ボスカリド、アゾキシストロビン、トルナフテート) も含まれていました。トルナフテートは、流出の亢進により多剤耐性を示す分離株を特定するために使用されました。 b〜d 実験進化中に収集された分離株、およびC、B、およびPにそれぞれ継続的に曝露された系統についてスコア化された表現型耐性プロファイルのヒートマップ。各系統および殺菌剤試験について、4 回の反復から収集した 12 株の耐性評価スコア (0 ～ 4; 茶色のスケールで表す) が、対照と比較して交互の体制にさらされた系統の胞子濃度の 3 ～ 4 つの臨界値について示されます。ライン (最終周波数 ≥15%、グレースケールで表されます)。連続的な B、C、または P 選択下の系統の構造は、抵抗性進化のこれらの異なる段階間で顕著な変化を明らかにしました (AMOVA; 0.273 < Fst < 0.453; P < 0.001)。

実験の最後に、各系統の進化した個体の表現型耐性プロファイルを確立することによって、交替体制の予想されるより大きな選択の不均一性の影響を調査した。したがって、選択した分離株の12の異なる試験モダリティの下での平均増殖能力を分析し（図4a）、試験した分離株の起源に応じたこれらの表現型耐性プロファイルの多様性を示すヒートマップを確立しました（図4b）。直接選択体制下で進化する株のプロファイルは、一般に、交代体制下で進化する株のプロファイルよりも狭く、多様性が低かった。 PCAはこの発見を確認し（図4c）、直接選択クラスターは他のクラスターよりも集中しており、選択に使用されなかった殺菌剤（例：ボスカリド、異なる化学クラスの別のSDHI、およびアゾキシストロビンおよびトルナフテート）に対する耐性を示すクラスターから十分に分離されていました。異なる動作モード）。系統の多様性は、PCA の第 2 軸を構成する低リスク殺菌剤 (P) に対する耐性によってさらに説明されました。多重耐性または交差耐性の幅は、選択体制で使用される AI の数に応じて大幅に増加し、程度は低いですが、交替パートナーに依存しました。トルナフテートに対する耐性は、多剤耐性を反映し、長い交代リズムで交互の殺菌剤投与計画で処理された系統で有意に高かった。耐性の強さは、中リスクおよび低リスクの殺菌剤を含む交替によって大幅に減少しましたが、選択体制内の AI の数が増加し、交替リズムが長くなるとわずかに増加しました。

a 実験終了時に、さまざまな選択方式（つまり、連続または交互曝露後、交互リズム = 1 サイクル）で得られた平均表現型抵抗プロファイル。図は、各選択計画の 4 つの反復系統から収集された 12 株のうち、試験殺菌剤に対して耐性 (評価スコア > 0) を示す分離株の割合を示しています。テストとスコアは図 3 の凡例に記載されています。 b 実験進化の終了時の表現型耐性プロファイルのヒートマップ。耐性評価スコア (0 ～ 4; 茶色のスケールで表される) は、13 の選択レジームのそれぞれについて収集された 12 の分離株のそれぞれについて示されます (図 1 に示すように、レジームごとに 4 つの複製系統; 虹のスケールで表されます)。）およびテストされた各殺菌剤について。系統の構造は選択レジーム間で大きく異なりました (AMOVA; Fst = 0.455、P < 0.001)。交代はジェネラリスト表現型に有利です。系統が耐性である AI の数 (トルナフテートを除く) は、選択体制で使用される AI の数とともに増加し (χ2 = 36.5; df = 2; P = 10−8)、依存性もありました。程度は低いですが、交代パートナーに関しては。同様に、いくつかの病原体における多剤耐性の指標であるトルナフテートに対する耐性は、選択レジーム (χ2 = 4.91; df = 2; P = 8 × 10−3) および交互リズム (χ2 = 3.85) で使用される AI の数とともに増加しました。 ; df = 2; P = 0.022)。評価スコアで評価される抵抗の強さは、交代のすべての構成要素によって大きく影響されました。特に、中リスクおよび低リスクの殺菌剤を含む代替薬は耐性の強さを減少させた（それぞれ F = 70.17; df = 1,225; P = 6 × 10−15 および F = 57.06; df = 1; P = 10−12 ）。対照的に、選択レジームで使用された交互リズムとAIの数は、抵抗の強度をわずかに増加させました（それぞれF = 4.91; df = 2; P = 0.008およびF = 3.85; df = 2; P = 0.02）。 c 実験終了時のすべての系統の表現型耐性プロファイルに関するPCAは、独立したAI（進化実験中の選択には使用されません; AzoおよびBosc）および低リスク殺菌剤（P）による構造を示しました。 CS コントロール溶媒ライン。

交替体制にさらされた株のより広範な耐性プロファイルは、多重耐性の選択（すなわち、同じ株内で、それぞれが単一の殺菌剤に対する耐性を与える複数の変異の同時選択）および/またはジェネラリスト耐性（すなわち、多面発現性変異の選択、殺菌剤に対するより一般的な耐性に関連する）。我々はまず、さまざまな表現型の耐性プロファイルに対応する 141 株の分離株において、カルベンダジム、プロチオコナゾール、およびベンゾビンジフルピルの標的をコードする遺伝子を配列決定することにより、これらの仮説を検証しました。直接カルベンダジム選択下で進化した少数の分離株では、β-チューブリンの E198K 置換のみが検出されました。この標的部位の変異は、12 種の真菌種の野外分離株および線虫にベンゾイミダゾールに対する高度の耐性を与えることが報告されています 50,51。 tub2、cyp51、sdhB、sdhC、または sdhD について確立された 330 の全遺伝子配列と比較して、他の変化は記録されませんでした。 tub2、sdhC、およびcyp51のプロモーター領域の体系的な遺伝子型決定では、祖先分離株と比較して、これらの株のインデルは明らかにされませんでした。殺菌剤誘導なしで培養した後、qRT-PCRによって定量化されたこれらの遺伝子の正規化発現は、祖先分離株の発現と比較しておよそ0.5から4の間で変動しました（補足図S2）。これらの弱い変異には、対照系統から収集された感受性の高い分離株が含まれていたため、これら 3 つの標的遺伝子の過剰発現がデータセット内で機能しないか、あるいはむしろ弱かったと仮定しました。流出の亢進は、それ自体低RFに関連する非標的部位耐性メカニズムであるが、Z. triticiにおいて無関係な化合物に対する交差耐性を引き起こす43。野外株では、MFS1 トランスポーター遺伝子のプロモーター領域への挿入によって決定されます 52。この実験で収集された249株の系統的な遺伝子型解析により、特にトルナフテート耐性を示す株ではmfs1プロモーターの長さに変化がないことが明らかになった。ただし、qRT-PCRでは、殺菌剤誘導なしで栽培され、交替計画を受けた系統から収集された8つの分離株のうち3つで、祖先株と比較して約5倍、11倍、および30倍のmfs1の過剰発現が明らかになりました（補足図S2）。。これらの分離株は、中程度から低スコアのトルナフテート耐性を示しました。全体として、これらの発見は、交替成分が一般的な表現型に有利であり、MFS1トランスポーターによる流出の亢進を伴い、一部の分離株において野外で起こるものとは異なるゲノム変化によって調節されることを示唆している。トルナフテート感受性スコアと mfs1 発現の間に観察された低い相関関係は、おそらく他の未知の非標的部位耐性メカニズムに加えて、未知のトランスポーターもこの状況で頻繁に観察されることを意味します。

この研究は、局所集団の適応分化に影響を与える要因など、時間的適応における概念的問題を調査するためのアプローチとしての実験進化の価値を確認しています48、53、54。今回我々は、実験的進化アプローチと経済的に重要なコムギ病原体 Z. tritici を一般原理のモデルとして使用し、一時的な不均一性が殺菌剤交代方式で処理された系統における殺菌剤耐性の進化を緩和できることを実証した。これらの実験は、殺菌剤選択の時間的不均一性の要素と、耐性動態および進化した分離株の一般性または特殊性の両方との間の関係を明らかに強調している。この実験計画により、以前に雑草、昆虫、および細菌12、29、56、57、58、59。

具体的には、3 つの異なる殺菌剤を使用したところ、耐性リスクが何であれ、単一の殺菌剤を継続的に使用する場合と比較して、全体の耐性進化速度を遅らせるという点で、代替は中立か有益であることがわかりました。すべての場合において、代替戦略は、少なくとも低リスクの殺菌剤の継続使用と同様に実行されました。殺菌剤によって加えられる選択圧は、順序戦略よりも長期間にわたって広がるため、交代は特定の殺菌剤に対する耐性の蓄積を遅らせる可能性がある21。しかし、これは、殺菌剤特異的耐性進化速度 (ρf) が継続使用戦略と交代戦略で類似しており、交代パートナーや交代リズムとは無関係であることを示唆しています。対照的に、代替コンポーネントの影響を分析する際に、可変のρf 値を取得し、代替パートナーと比較したその作用機序によって決定される殺菌剤耐性リスクが、戦略の選択と全体的なパフォーマンスに及ぼす主な影響を明らかにしました。。したがって、交替内の AI の数を増やすと、交替内に既に存在する AI に対する追加 AI の耐性の固有リスクに応じて、殺菌剤固有の耐性進化速度が増加または減少する可能性があります。これは、サイクル内で特定の AI によって選択された複数の遺伝子型の相対的な適応度コストと耐性レベルのバランスを反映している可能性があり、異なる AI による選択を対比する前に、次のサイクルの開始時に集団の構成が最終的に決定されます。手術。私たちの観察は、現在の人口構成との関係で、時間の経過に伴う各パートナーの相対的な有効性も反映しています。系統の絶滅を防ぐ必要がある場合、サイクルの初期において、対照系統から感受性分離株が移入することは、抵抗力の低下に寄与しましたが、両方のパートナーの相対的な有効性を促進しました。最後に、環境の時間的不均一性が進化の方向を決定する可能性があり、よりきめの細かい時間的環境（世代時間よりも短い時間スケールで環境が変化する環境）は、個体群の多様性を維持しながら適応を遅らせるのに効果的である60,61。私たちの設計では、1週間の交代リズムでさえ、Z. triticiの世代時間（1サイクルあたり6〜7世代と推定）を大幅に超えていたため、テストされたすべての時間的環境、特に3週間の交代リズムは粗粒でした。交代。ただし、交代リズムは、特定の殺菌剤の耐性進化速度に対して他の構成要素よりもはるかに小さい影響を与えました。これは、多くの農業システムでは殺菌剤散布の頻度によって粒度の粗い環境が生じる可能性が高いため、圃場戦略の設計にある程度の柔軟性が可能であることを意味しています。この分野で最も一般的に使用されている混合戦略に対するこれらの選択ドライバーのそれぞれの関連性は、さらなる研究で興味深い比較ができる可能性があります。

我々はここで、植物病原性真菌において、殺菌剤散布の時間的変動が耐性菌株におけるより高度な一般性と相関している可能性があることを確認した。直接選択（同じ殺菌剤の継続使用）の過程での耐性表現型プロファイルの分析により、ライン内の表現型の高い多様性と、時間の経過とともにこの多様性が集中することが明らかになり、最終的には専門家のプロファイルに達しました。あい。これらの動態は、相対的な適応度コストと局所集団における耐性の程度に応じて、有益な突然変異の増加、選択、固定、または消滅を伴う集団構成の継続的な変化とも一致しています62。したがって、高リスク殺菌剤は、高い耐性の根底にある独特の変化（例えば、Cに対する高い耐性を与えるtub2 E198K変異体）の選択によって生成されるものなど、スムーズな適応状況を探索することができる。対照的に、中リスクおよび低リスクの殺菌剤は、それほど平坦でない地形を探索することができます。理論によれば、変動する環境では全体的な最適な適応度が達成される可能性は低くなります63。交差耐性を示さない AI に関連するそれぞれの経路を組み合わせ、前述の個体群動態を考慮すると、交代体制下で進化する系統が起伏の多い地形を探索し、ある殺菌剤に対する耐性突然変異を抑制し、他の殺菌剤に対する耐性をトレードオフすることが予想されます。殺菌剤を使用するか、長期にわたって平均適応度がより高い遺伝子型を優先する29,64。このシナリオは、交差耐性（新しい AI に対する耐性を含む）のより広範なパターン、より低い耐性スコア、交互処理を受けた系統から収集された分離株では、トルナフテートに対する耐性（流出の亢進に関連する）の高頻度が観察されました。耐性分離株の代表的なサブサンプルの分子分析では、選択された殺菌剤の標的をコードする遺伝子の変異はほとんど検出されず、すべてではないが少数の耐性株でMFS1トランスポーターによる流出の亢進が働いていることが示された。したがって、私たちのコレクションは、ゲノミクスの進歩を利用して、私たちのデータセットで主に機能している適応の未知の遺伝的および非遺伝的基盤を解明する良い機会を提供します。これらの未知の耐性メカニズム（つまり、標的の変化や過剰発現以外）も、私たちが疑うことなく自然界で機能している可能性があり、したがって、耐性形質に見落とされている影響を与えている可能性があります65、66、67。実際、ゲノム分析では、致死量未満の殺菌剤に曝露された真菌病原体では、SNP だけでなく、インデル、コピー数変異、転移因子挿入、染色体重複、および異数性も発生することが示されています 68。交代および配列戦略からの分離株における未知の耐性機構に関する我々の観察は、先験的な耐性機構を必要としない、殺菌剤に対する真菌の適応のこのパンゲノム特徴付けと一致する。この発見は、Z. tritici が、どのような変異が選択されたとしても、耐性を管理するための一般原則を知らせるだけでなく、非標的部位の適応のさまざまな色合いを探索するための関連モデルでもあるという概念の証明をもたらしました。また、実験の過程で交替成分が抵抗力の進化速度に異なる影響を与えることもわかりました。交代は高リスク殺菌剤に対する耐性のダイナミクスの確立段階を大幅に遅らせ、出現期以降は低リスク殺菌剤のほうが高リスク殺菌剤よりも優れた性能を発揮することを示唆している。対照的に、高リスクの殺菌剤との交互投与は、低リスクの殺菌剤に対する耐性の初期段階に達するまでに必要な時間を短縮し、高リスクの殺菌剤が耐性強度の低い変異を逆選択しないことを示した。最後に、実験的進化は、natura 54 における進化の簡略化されたモデルを提案し、選択要素の相対的な影響を強調することによって耐性管理の一般原則についての理解を深めました。実験室環境のため、私たちの実験計画は有限の集団サイズ、低い祖先多様性、限られた時間スケール、および無性生殖を前提としています。しかし、Z. tritici を含む多くの植物病原体は、個体数が大きく、遺伝的多様性が高く、有性生殖と無性生殖の両方を行うため、宿主環境と非生物的環境に同時に適応する必要があります69。遺伝子流動は、進化するメタ集団間でも起こると予想されます。これらの違いのため、我々は、この実験のために野外で発生するものとは異なる適応突然変異を選択することは、抗真菌管理戦略についての推論におけるこの研究の関連性を制限しないと感じた。これらの制限を超えて、私たちの研究は、すべての代替戦略が耐性を防ぐために同じパフォーマンスを保証するわけではないことを明確に示していますが、これらの戦略が個々の殺菌剤の継続使用に関連するリスクと比較して耐性のリスクを増加させる例はありませんでした。そうすれば、社会環境上の需要が高まっている殺虫剤の負荷を減らしながら耐性を遅らせるための混合戦略に代わる選択肢が提供されるかもしれない。実際、例えば、セプトリア葉斑病を防除するために小麦に使用される市販の混合物は、個々の使用に推奨されている割合に近い割合で殺菌剤成分を組み合わせており、その結果、ほぼ 2 倍の量の殺菌剤が適用されることになります70。したがって、代替戦略について関係者を教育する取り組みは、代替のさまざまなコンポーネント間の相互作用の最適化に焦点を当てる必要があります。この研究の結果は、特に毎年複数回の散布が頻繁に行われる多年生作物において、時間的不均一性に基づいて植物病原体の耐性管理を効果的に調整する道を切り開きます。また、環境粒子が適切であれば、時間的不均一性による耐性管理が可能であるとも主張します61。一般に環境は粒度が細かく、異なる作用機序を持つ化合物に世代を交代して曝露する必要があるが、粒度の粗い時間的変動が潜在的に許容できることがわかった。さらに、AI が循環する順序は進化の軌跡に影響を与える可能性があります。モデリングは、出現する突然変異をできるだけ効率的に制御するために、最も効果的な AI を最初に使用する必要があることを示唆しています 21 が、これを確認するには実験的進化実験でのさらなる調査が必要です。異なる固有の耐性リスクを持つ AI を含む交替アプローチの全体的なパフォーマンスは、耐性のリスクが最も低い AI を犠牲にして達成されます。これは、交替シーケンスでの高リスク AI の使用は制限されるべきであること、および/または、同様のリスクを持つ AI が優先されるべきです。 AI 間の相対リスクは、パートナーごとに異なる用量や交替リズムを使用するか、交替する AI の一部を混合することによって、現場で調整することもできます。混合物と同様に代替戦略の有効性もまた、集団がナイーブではなく、複数の耐性はもちろんのこと、各殺菌剤に対する耐性の初期レベルが異なる現実世界のケースでも直面する必要がある71。最後に、最適化された構成要素を備えた合理的な戦略を設計するには、耐性の進化速度と進化した個体の汎用性の程度との間の進化的トレードオフを考慮する必要があり、これは将来の行動様式の有効性に疑問を投げかける可能性がある。この点において、雑草、害虫、病気の将来の防除は、多様な作用機序に基づくだけでなく、全体的な適応を緩和するための非化学的戦略を含む統合的害虫管理を考慮すべきである72。

我々は、祖先分離株として IPO-323 を使用して、すべての系統、つまり殺菌剤の選択の下でさらに進化する類似の祖先集団を見つけました。この分離株はあらゆる殺菌剤に対して感受性があり、Z. tritici の高品質参照ゲノムのソースでした 73。ストック胞子懸濁液を 20% グリセロール中で -80 °C に保ち、固体 YPD プレート (20 g L-1 ブドウ糖、20 g L-1 ペプトン、10 g L-1 酵母エキス) の接種のために室温で穏やかに解凍しました。、２０ｇＬ−１寒天；ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を使用し、次いで暗所で１８℃で７日間インキュベートした。これらのプレートを液体 YPD (前述のとおり、ただし寒天は含まない) で前培養物を調製するために使用し、実験開始前に 7 日間同様の条件で 150 rpm で振盪しました。

進化実験に使用した培地は、この長期実験の汚染を防ぐために、100 mg L-1 のストレプトマイシンおよびペニシリンを補充した液体 YPD でした。培養容器は、25 mLの培地を含む50 mLのホウケイ酸三角フラスコであり、首にカード綿が挿入されていた。培養物は、サイクル期間中、相対湿度 70%、18 °C の暗所で 150 rpm で振盪しながら増殖させました。これらの条件では、Z. tritici を酵母様の形態に保つことができ、均一な液体培養物を得ることが可能になります 74。

集団サイズは、ガス透過性膜（Breathe Easy®; Diversified Biotech）で密閉された 96 ウェルマイクロタイタープレート（Sarstedt）内の真菌培養物の 200 μL 複製 2 つについて 405 nm での光学密度（または OD405）を測定することによって日常的に決定されました。。使用した実験条件では、分光光度計 (SpectraMax M2、Molecular Devices) の検出閾値は 3.5 × 105 胞子 mL-1 でした。真菌培養物の OD405 を、非改変培地の OD405 に対して正規化しました。胞子濃度は、段階希釈および血球計算盤ベースの胞子定量化を使用した条件での予備実験に基づいて校正された数学的モデルを使用して OD405 から推定され、相互検証されました (R² = 0.91)。胞子 mL-1 で表した集団サイズは、さらなる統計分析に使用されました。

実験的進化実験では、異なる作用機序を代表する 3 つの殺菌剤に対する耐性を選択しました: カルベンダジム (C; ベンズイミダゾール、有糸分裂における β チューブリンの集合を妨害)、ベンゾビンジフルピル (B; ピラゾールカルボキサミド、複合体 II、コハク酸デヒドロゲナーゼを阻害、ミトコンドリア呼吸鎖）およびプロチオコナゾールの活性代謝物であるプロチオコナゾールデスチオ（P; トリアゾール、ステロール生合成中にステロール 14α-デメチラーゼを阻害する）。これらの作用機序は、対照的な耐性リスクと関連しています。殺菌剤を８０％エタノールに溶解した。この溶媒の濃度は、最終培養体積の 0.5% を超えることはありませんでした。

選択用量は、祖先株の用量反応曲線を調べることによって選択されました。各殺菌剤用量について、107 個の IPO-323 胞子を使用して三角フラスコ内の YPD に接種し、OD405 測定前に 7 日間インキュベートしました。 OD405 データはロジスティック回帰によってモデル化され、各殺菌剤の EC50 (増殖の 50% を阻害する濃度)、EC95 (増殖の 95% を阻害する濃度)、および最小阻止濃度 (MIC) の値を計算しました。一部の殺菌剤では 99% 阻害が達成されず、MIC が溶媒中の殺菌剤の溶解度を超えるため、最終的に EC95 を選択用量として使用することを選択しました。使用した選択用量は、ベンゾビンジフルピルについては 0.5 mg L-1、カルベンダジムについては 0.1 mg L-1、およびプロチオコナゾール-デスチオについては 0.005 mg L-1 でした。

図1bに示すように、耐性進化に対する交代の3つの要素のそれぞれの影響を分析するために、選択レジームが組織されました。まず、処理系統では、交代体制における AI の数は 1 つ (直接選択) から、経時的に交代する 3 つの異なる殺菌剤までの範囲でした。第二に、耐性の本質的リスクは MoA によって異なり、農薬会社によってベンズイミダゾール (C で表される) では高く、SDHI (B で表される) では中程度から高、DMI (P で表される) では中程度であると予測されました 75。実際には、実験でこれらの殺菌剤の同様の相対的なランキングが観察されたため、簡単にするために、この研究全体を通じて、それぞれ高リスク、中リスク、低リスクの殺菌剤に言及しました。最後に、同じ殺菌剤への曝露期間（または交代リズム）は、直接選択（0、交代なし）では連続的で、1（サイクルごとに殺菌剤を変更）から3（3サイクルごとに殺菌剤を変更）サイクルの範囲でした。 1 サイクルの交互リズムについてのみテストされた 3 種類の殺菌剤の交互を除いて、これら 3 つの考えられる成分のすべての組み合わせがテストされました。

祖先集団は、IPO-323 の 7 日間の液体 YPD 前培養から設立されました。この胞子懸濁液の密度を 2 × 107 個の胞子 mL-1 に調整し、各三角フラスコに 107 個の胞子 (500 μL) を接種しました。結果として得られた開始濃度 4 × 105 胞子 mL-1 は、予備実験の結果に基づいて、突然変異が発生する可能性が高い大集団と、使用した実験条件での培養保持能力を超えない間の妥協点を提供しました。 14 の選択計画 (1 つの対照および 13 の異なる処理) のそれぞれを 4 回繰り返しました (選択計画ごとに 4 行)。対照溶媒系統には 0.5% の溶媒しか含まれていませんでしたが、処理系統は図 1b に示すように処理され、56 の独立した系統が生じました。殺菌剤も溶媒も含まない対照系統は、移入しやすい細胞を提供するためだけに生育され（以下を参照）、戦略を比較する統計分析には含まれませんでした。

実験的進化は、それぞれ 7 日間の 12 サイクルにわたって行われました (1 サイクルあたり約 6 ～ 7 世代)。このサイクル期間は、コントロールラインがプラトーに達する前に指数関数的増殖期に留まる時間にほぼ対応します。 OD405 は各サイクルの終わりに測定され、上記のように集団サイズに変換されました。処理した系統の OD405 を、対照溶媒系統の平均 OD405 で正規化しました。移すたびに、500 μL の進化する培養物 (つまり、培地の総量の 2%) を、新鮮な培地を含む新しい三角フラスコに移しました。 500 μL の培地中の胞子数が 107 個未満の場合（これは耐性が発現する前のケースです）、未処理集団の 1 つから適切な数の胞子を追加して、存在する胞子の数が最大になるようにしました。 107. 開始個体群のサイズは、各新しいサイクルの開始時に系統間で均等化され、そのプロセスは野外状況で発生する移民を模倣しました。 4 つの複製のそれぞれについて、実験全体を通じて同じ起源集団が移民に使用されました。予備実験では、毎週のボトルネック後の人口絶滅を防ぎ、遺伝的浮動を最小限に抑えるために移民が有用であることが判明した。

各サイクルの終了時に、各ライン 2 mL をグリセロール (25%) と混合し、凍結し、さらなる分析のために -80 °C で保存しました。

各系統のマルサス的成長 76 は次のように計算されました。

そして、次のように溶媒制御線 C のそれに対して正規化されます。

各選択体制について、平均マルサス成長率 (「全体的な耐性進化率」または ρ) は、12 サイクルにわたって計算された \({M}_{{it}}^{n}\) の平均であり、定量的な要約を構成します。実験全体にわたる 4 つの複製の抵抗の増加。同様に、ρf (「殺菌剤固有の耐性進化率」) は、この殺菌剤が使用された時間セグメントのみを考慮して、交代体制中の殺菌剤 f に関連する耐性の増加を反映します。このアプローチにより、同じ数の殺菌剤散布（6 回の散布、ただし 4 回しか散布されなかった BCP 体制を除く）による選択を、異なる選択体制の文脈で比較することが可能になりました。 ρ と ρf は ANOVA 線形モデルで説明され、最初は交替パートナーを定性的な固定因子として考慮し、次に各交替パートナーの交替リズムを考慮しました。使用された基準は、殺菌剤の継続的な適用でした。

正規化マルサス増殖 \({M}_{{it}}^{n}\) が特定のしきい値 (15%、25%、50%) に達するのに必要な曝露時間 (つまり、特定の殺菌剤に曝露されるサイクル数) %、75%、90%) は、AI の数、交替パートナー、および交替リズムを考慮した Cox 生存分析で調査されました。

すべての分析と図は、R 4.0.4 と補足メソッド S1 にリストされている追加パッケージを使用して作成されました。

我々は、耐性動態の重要な時点、すなわち正規化マルサス増殖が15％（初期耐性）、75％（中間耐性頻度）に達した時点で、直接選択体制から純粋株を単離することにより、選択過程における耐性表現型の変化を評価した。実験終了時点では、対照系統と比較して 98% (確立された耐性) でした。 0B 系統の場合はサイクル 1、5、6、および 12 から、0C 系統の場合はサイクル 2、3、および 12 から、0P 系統の場合はサイクル 5、6、および 12 から、選択体制ごとに 12 個体 (反復ごとに 3 個体) を分離しました。。これにより、合計 120 株が分離されました。また、すべての選択体制について、最終サイクルの終わりに 12 株 (複製ごとに 3 株) を体系的に単離することにより、選択体制内および選択体制間の表現型の多様性を調査しました。これにより、さらに 129 株が分離されました。分離株は、各サイクルの終わりに収集されたグリセロール集団ストックから回収されました。 2回の連続した単離を、100 mg L-1 ストレプトマイシンおよびペニシリンを補充したYPD固体培地で実施した。単一分離株は、25% グリセロール中で -80 °C で保存されました。

249 の分離株の交差耐性パターンは、液滴テストで確立されました。 107、106、105、および 104 個の胞子 mL-1 懸濁液を、12 cm 四方のペトリ皿に列に組織化された液滴として堆積しました。これらのプレートには、差別的な用量の殺菌剤が添加された YPD が含まれていました。試験した15の処理には、0.5%溶媒と殺菌剤B、C、Pを選択用量(それぞれ0.1、0.5、0.005mg.L-1)、および選択用量の2倍(0.2、1、0.01mg.L-1)で使用した対照が含まれていました。それぞれ mg L−1）。 3 つの殺菌剤のペアの混合物も含まれました (各殺菌剤は、参照耐性菌株と感受性菌株の混合物における最低の識別用量であることが判明したため、選択用量の 0.8 倍で使用されました)。最後に、ジェネラリスト耐性の検出のために、実験進化には使用されなかった殺菌剤 (0.5 mg L-1 アゾキシストロビン、2 mg L-1 ボスカリド、および 2 mg L-1 トルナフテート) も含めました。特に、トルナフテートは、Z. tritici の野外分離株で記載されているように、非特異的多剤耐性 (MDR) を引き起こす殺菌剤流出の亢進を示す個体を特定しました 43。祖先株 IPO-323 と、それぞれが選択に使用される 1 つまたは複数の殺菌剤に耐性のある 3 つの野外株が、対照株として含まれました。 7 日間のインキュベーション後、真菌増殖の有無に応じて液滴を 0 または 1 でスコア付けしました。増殖が観察された希釈液滴の数に応じて、各株の合計スコアを 0 (感受性) から 4 (0 を超える場合は耐性) までの範囲で確立しました。各菌株について、耐性表現型プロファイルは、14 セットの殺菌剤条件に対して確立されたスコアの連結として決定されました。合計 132 の異なる耐性表現型プロファイルが特定されました。

実験の過程で 0C、0B、および 0P 直接選択系統から単離された株の進化は、耐性動態の 3 ～ 4 つの臨界時間ウィンドウ中に検出された 13 ～ 17 の耐性表現型プロファイルのヒートマップによって表されました。ユークリッドのペアワイズ距離は、行と列の樹状図を使用して、これらのプロファイルの階層的クラスタリングに使用されました。実験の最後に 56 系統で検出された 102 の耐性表現型プロファイルのヒートマップも同様に作成されました。同じデータサブセットに対して主成分分析 (PCA) も実行しました。

実験の最後に測定された選択レジーム内および選択レジーム間の多様性は、Arlequin プログラムで実行された分子分散分析 (AMOVA) によって定量化されました 77。 AMOVA は通常、分子データに使用されます。ここでは、特定のテストのさまざまなスコアがさまざまな対立遺伝子または対立遺伝子の組み合わせに対応すると仮定しました。

最後に、系統が耐性である AI の数と耐性の強度 (つまり、各テストおよび各系統について、個々の液滴スコアから計算された平均耐性スコア >0) が、最後に記録された耐性表現型プロファイルから計算されました。実験の様子。 AI の数、交代リズム、交代パートナー (およびそれらの相互作用) がトルナフテートに対する耐性に及ぼす影響、および系統が耐性を示した AI の数と耐性の強さを線形モデル (準ポアソン GLM モデル、ポアソン GLM、それぞれ対数変換線形モデル)。

すべての分析と図は、R 4.0.4 と補足メソッド S1 にリストされているパッケージを使用して作成されました。

B、C、および P に対する標的部位耐性は、Z. tritici の野外株で報告されており、コハク酸デヒドロゲナーゼ (sdhB、sdhC、または sdhD)、β-チューブリン (tub2) のサブユニットの一部をコードする遺伝子の変異と関連しています。および 14α-デメチラーゼ (cyp51) それぞれ 34、39、40、41。飛沫試験で使用した参照分離株に加えて、飛沫試験で B、C、または P 耐性のスコアが 1 を超えた処理集団からの分離株を、標的遺伝子配列決定のために保持しました。関係する殺菌剤の標的遺伝子は、補足方法 S2 に詳述されている PCR 条件下でプライマーを使用して増幅され、選択された耐性表現型プロファイルを代表する単一分離株について、サンガープロトコール (Eurofins Genomics、ドイツ、エーベルスベルクによる) で配列決定されました。無作為に。 141 人から DNA を抽出し、65 個の sdhB、69 個の sdhC、66 個の sdhD、83 個の tub2、および 47 個の cyp51 配列が得られました。

これらの標的遺伝子の過剰発現の可能性を特定するために、同じ分離株のプロモーター領域を PCR で増幅し、インデルを検索しました (補足方法 S3)。遺伝子 mfs1 のプロモーターへの挿入は、Z. tritici の野外分離株で MDR を引き起こすことが示されています。この遺伝子の PCR 後のアンプリコンサイズは、MFS1 プロモーターの変化を確認するために、以前に記載されたプロトコールと参照株を使用して、249 の分離株について系統的に決定されました 52。最後に、スペシャリストまたはジェネラリストの表現型を表すために、B、C、P、および/またはトルナフテートに対して高い耐性スコアを示す 8 つの分離株がコレクションの中から選択されました。それらの RNA は、前述のように、殺菌剤に曝露することなく 6 日間の培養後に祖先分離株の RNA と同時に単離されました。 sdhC、tub2、cyp51、および mfs1 の発現は、tub2、cyp51、および mfs1 の発現正規化のためのハウスキーピング遺伝子として EF1α および UBC を使用し、sdhC 発現の正規化のためのハウスキーピング遺伝子として tub2 を使用して、qRT-PCR によってこれらの分離株について定量されました (補足方法 S4) ）。これらの遺伝子の正規化された発現は、2-ΔΔCtとして示されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

データは、https://doi.org/10.1101/2021.07.11.451819 の Dryad リポジトリに保管されました。他のすべてのデータは、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。

スクリプトは、アクセッション https://doi.org/10.5281/zenodo.5106475 で Zenodo に寄託されました。

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この博士課程の運営組織を促進してくださったファブリス・ブラン氏に感謝します。学生時代。また、私たちの調査結果について的確なコメントをくださったステファノ・トリアーニ博士、ステファニー・ベドオム博士、マト・ラガトール博士にも感謝いたします。 Z. tritici の進化した分離株における標的遺伝子の発現の分析にご協力いただいた Alicia Noly に非常に感謝しています。 AB は博士号のサポートを受けました。フランス高等教育・研究・イノベーション省とシンジェンタ・フランスが、国立研究技術協会（ANRT）が監督するCIFREプログラムを通じて資金提供する学生制度。この研究は、STRATAGEME プロジェクトを通じて INRAE の植物衛生部門によって支援されました。

フローレンス・カーペンティエ、アン・ソフィー・ウォーカーなどの著者も同様に貢献しました。

パリサクレー大学、INRAE、UR BIOGER、91120、パレゾー、フランス

アガテ・バル、フィロメーヌ・デプレオー、クレマンティーヌ・デュプレ、アンヌ・デレデック、アンヌ＝ソフィー・ウォーカー

Paris-Saclay University, INRAE, UR Maiage, 78350, Jouy-en-Josas, France

フローレンス・カーペンティエ

AgroParisTech、91120、パレゾー、フランス

フローレンス・カーペンティエ

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A.-SW と FC が研究を考案、設計し、AD と ABAB の協力を得て実験的進化実験を実施しました。 PD と CD は進化した株を単離し、それらの表現型と遺伝子型を確立しました。 AB と FC は、A.-SW と AD の協力を得て統計分析を実行しました。論文は A.-SW と AB によって書かれ、すべての著者からの追加の貢献がありました。

アン＝ソフィー・ウォーカーへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Nichola Hawkins と他の匿名の査読者に感謝します。主な取り扱い編集者: Diane Saunders および Luke R. Grinham。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Ballu、A.、Despréaux、P.、Duplaix、C. 他。抗真菌薬の代替は耐久性にとって有益ですが、一般的な耐性を犠牲にします。 Commun Biol 6、180 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04550-6

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受信日: 2021 年 10 月 22 日

受理日: 2023 年 2 月 3 日

公開日: 2023 年 2 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04550-6

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